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        細胞凍存的小常識

        必須將凍存在-196℃液氮中的細胞快速融化至37℃,使細胞外凍存時的冰晶迅速融化,避免冰晶緩慢融化時進入細胞形成再結晶,對細胞造成損害。

        細胞復蘇步驟

        一.實驗前準備:
        將水浴鍋預熱至37℃。
        細胞實驗室進行常規消毒,用75%酒精擦拭并且使用紫外線照射40min的超凈工作臺臺面。
        在超凈工作臺中按次序擺放好消過毒的離心管、吸管、培養瓶等。

        二.取出凍存管:
        根據細胞凍存記錄按標簽找到所需細胞的編號。
        從液氮罐中取出細胞盒,取出所需的細胞,同時核對管外的編號。

        三.迅速解凍:
        迅速將凍存管投入到已經預熱的水浴鍋中解凍,并要不斷地搖動,使管中的液體迅速融化。
        約1-2min后凍存管內液體完全溶解,取出用酒精棉球擦拭凍存管的外壁,再拿入超凈臺內。

        四.平衡離心:
        用架盤天平平衡后,放入離心機中1000r/min,離心5min。

        五.制備細胞懸液:
        吸棄上清液。
        向離心管內加入10ml預熱的培養液,吹打制成細胞懸液。
        用培養液懸液混懸沉淀細胞,調整細胞濃度,放培養箱中培養。

        六.細胞計數:
        細胞濃度以5×105/ml為宜。

        七.培養細胞:
        將符合細胞計數要求的細胞懸液分裝入培養瓶內,將培養瓶放入37℃,5%CO2的培養箱內2-4小時(或者24-48小時)后換液繼續培養,換液的時間由細胞情況而定。

        八. 記錄復蘇日期:
        細胞凍存和復蘇是細胞培養技術里面容易出問題的部分,因此必須注意以下幾點~

        注意無菌操作。
        取細胞的過程中可能會接觸液氮,一定注意帶好防凍手套,護目鏡。
        此項尤為重要,如果凍存管密封不嚴,細胞凍存管可能漏入液氮,解凍時,在水浴中搖晃,凍存管中的氣溫急劇上升,可導致爆炸,所以,一定要戴保護眼鏡和手套,復蘇過程中應蓋上恒溫水浴鍋的蓋。
        應在1-2min內使凍存液完全融化。如果復溫速度太慢,則會造成細胞損傷。另外,細胞復蘇后的操作Hao在4℃冰浴中進行,以減少冷凍保護劑對細胞的毒性。
        復蘇過程中,升溫的速率要大,把從液氮取出的細胞在短的時間內放入水浴鍋。
        離心前須加入少量培養液。細胞解凍后二甲基亞砜濃度較高,注意加入少量培養液可稀釋其濃度,以減少對細胞的損傷。

        細胞貼壁少的問題:教科書中說明凍存細胞解凍時1ml細胞液要加10ml-15ml培養液,經驗總結,培養基越少細胞越容易貼附。
        復蘇細胞分裝的問題:復蘇1管細胞一般根據情況可分裝到1-2只培養瓶中,分裝過多,細胞濃度過低,不利于細胞的貼壁。
        加培養基的量放入問題:這個量的多少的把握主要涉及到的問題是DMSO的濃度,從如果加培養基的太少,DMSO的濃度就會比較大,就會影響細胞生長,從以前的資料來看,DMSO的濃度在小于0.5%的時候對一般細胞沒有什么影響。還有一個說法是1%。所以如果凍存液的濃度是10%DMSO,那么加10ml以上的培養基就恰好稀釋到了無害濃度。

        初學者易犯的錯誤:
        水浴鍋未預熱或者未預熱到37℃直接融化。
        水浴鍋內凍存管太多,導致傳熱不佳,使融化時間延長。
        離心前忘記平衡,導致離心機損壞和細胞丟失。
        一次復蘇細胞種類過多,忘記更換吸頭和吸管,導致細胞交叉污染。
        解凍后的細胞要用和以前一樣的培養液和血清。因為每一種細胞都有自己特定的,并且已經熟悉了的生長環境。突然使用不一樣的培養液和血清,會造成細胞生長不良,甚至死亡,像水土不服一樣。

        結果分析:
        判斷細胞復蘇成功與否,需要看復蘇后細胞貼壁率及細胞存活率(細胞存活率將凍存管內剩余的細胞,用臺盼藍染色法檢測復蘇細胞的存活率。呈藍色的細胞為死細胞,活細胞不著色。用細胞計數板和計數器計數細胞,得出細胞存活率)。如果復蘇后95%以上的細胞貼壁,而且細胞的活性好,這就說明細胞復蘇的過程沒有問題。復蘇的細胞恢復到正常生長,達到正常的生長特性(比如細胞群體倍增時間等)后要再凍存以補充細胞儲存數量。

        公司簡介 / Company profile
        上海傳秋生物科技有限公司
        Shanghai Chuan Qiu Biotechnology Co.,Ltd.
               公司主要依托復旦大學、同濟大學等上海地區多家著名高校,擁有一支富有經驗的開發團隊,專業從事細胞及細胞...
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